（本館）「口之津の繁栄を知ることができる中世・近現代」をテーマとしています。

壁面グラフィックで表現した南蛮船来航の様子、天正遣欧少年使節に関する資料、三池炭鉱の石炭積込の様子や石炭業により栄えた口之津の町並みを再現したジオラマ、外洋航路の船員輩出日本一であったことを物語る多くの外国民芸品などを展示しています。また、明治から大正にかけて海外へ出稼ぎに行った「唐行き（からゆき）」さんの展示もしています。

（分館）県指定有形文化財の旧長崎税関口之津支署庁舎を資料館として活用し、口之津の人びとの暮らしを中心に昔懐かしいレトロな空間となっています。また、明治期に鹿児島県与論島の人びとが石炭積込みために口之津に集団移住した際に使った「与論長屋」を館内に再現しています。

口之津歴史民俗資料館では、口之津の民俗を中心とした資料の展示や収集保存、教育普及の場となっています。毎年地域の小中学生が校外学習をとおして地元の歴史を学んでいます。また、企画展の開催も行っています。